1. 抗原的制備

標準菌株的選擇：所用的菌種傷寒桿菌H901和傷寒桿菌O901應具有典型形態菌落及生化反應。在生理鹽水中不發生自身凝集，與特異血清有高度凝集者可作為菌種。

2. 菌液的制備

1) 原液制備：

H菌液的制備：將合格的傷寒桿菌H菌株接種于普通瓊脂的克氏瓶或大試管內 37℃孵育18—24小時。肉眼觀察有無雜菌生長，必要時作鏡檢。用無菌甲醛生理鹽水洗下菌苔，將洗下液體裝入無菌試管內，置37℃恒溫箱18—24小時以殺菌。得到原液。用作無菌試驗即將菌液接種于肉湯及瓊脂培養基培養4天，無活菌生長者才可使用。
菌液的制備：將合格的傷寒桿菌H菌株依上法培養后，用無菌0.5%石灰酸鹽水將菌苔洗下，洗液裝入無菌試管置于37℃溫箱中18—24小時殺菌得原液。經檢查無菌時可以使用(如無傷寒桿菌O菌株也可用H菌株制備O抗原。即用0.5%石灰酸生理鹽水洗下H菌菌液置100℃水浴60分鐘，破壞其H抗原即為O菌液。

2) 應用液的制備：

合格的原液用標準比濁管計算含菌落數目后，用生理鹽水稀釋至每毫升含菌10億。是為了應用液加入適量甲醛使其為0.25%，制備好的原液及應用液均保存在2—10℃冰箱中備用，有效期為1年。
菌液濃度的計算及稀釋法：
菌液的濃度可用麥克倫特氏標準比濁法來測定，方法如下：

a. 分別配制1%硫酸溶液及1%氯化鋇溶液

b. 取口徑相等質地相同的試管10支，依下表所示分別將硫酸及氯化鋇溶液加入，封固管口，注明號碼備用。
管號12345678910
1%BaCl2(ml)0.10.20.30.40.50.60.70.80. 91.0
1%H2SO4(ml)9.99.89.79.69.59.49.39.29.19.0
相當菌數(億/ml)36912151821242730

c. 將洗下的細菌原液放入與比濁管相同的試管中并予以一定稀釋。與標準比濁管相比較，視其濁度相當于比濁管的第幾管，然后將比濁管相當菌數乘以稀釋倍數即可得到每毫升中所含細菌的數量。如細菌原液1：5稀釋后其濁度與第3管相當，則原液每毫升含菌數為9ⅹ5=45億。

d. 菌液的稀釋

3．免疫方法

   1) 選擇體重2—3千克的健康雄兔2—3只，由耳靜脈采血1毫升，分離血清。與進行免疫用的細菌做凝集試驗，測定有無天然凝集素。如無或微量時，該動物可用于免疫。
   2) 將已稀釋的抗原按以下劑量及程序注入兔耳靜脈。
日期第1天第5天第10天第15天第20天
注射劑量0.5ml、1ml1、5ml、2ml、2.5ml
   3) 末次注射后7天耳靜脈采血1毫升，分離血清。用上述菌液作試管凝集試驗，滴定抗菌血清中抗體的效價，效價在1：2000以上可放血。若效價不高可再增量注射菌液1—2次，再行試血。試血合格可頸動脈放血(方法見附錄)。分離血清，加入防腐劑(如萬分之一的硫化汞)放4℃保存備用。